Elektronmikroskopi (EM) av basestrukturen




Biocenter Oulu Elektronmikroskjernestrukturen tilbyr tjenester og opplæring i de ulike elektronmikroskopi teknikker for analyse av biologiske prøver. Vi tilbyr også teknisk og vitenskapelig rådgivning innen forsøksplanlegging og dannelsen av prøveopparbeidelse og drift av elektroniske mikroskoper. Med alle de analyseteknikker er EM valgfritt. Vi er spesialister på IEM og ultrastructural analyse av modifiserte gener mus vev.

tjeneste

  • Plastic embedding, tynn seksjonering
  • Høytrykks frysing og fryse substitusjon (HPF-FS)
  • Immunelek- Mikroskopi (IEM)
  • negativ farging
  • tomograf
  • Søknader SEM / Fokusert Ion Beam - scanning elektronmikroskopi (SEM-FIB)
  • SEM Programmer / korrosjon cast teknikk

informasjon

  • instrumenter
  • booking Instrument
  • prøveopparbeidelse laboratorium
  • Kontaktpersoner
  • Montering instruksjoner av prøvene
  • bestillingsskjema
  • priser

publikasjoner

  • BCO EM Publikasjoner 2012-2015

embedding
Plast og tynn seksjonering

Prøven er fiksert både med en blanding av 4% paraformaldehyd og 1% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer, eller 2% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer, post-fiksert med osmiumtetroxyd, dehydrert med økende konsentrasjoner av aceton eller alkohol , og innebygd i plast harpiks (Epon). Ultratynne seksjoner (70-80 nm) er post-farget med uranylacetat og bly citrate før observasjon med TEM.



tynne seksjonert prøver epoxy embedded viser ultrastructure av E. coli, nevromuskulære krysset av muskelen av musen, barrieren av musen nyre glomerulus filtrering, og gris hjernebarken nervecellen.

Høytrykks frysing og fryse substitusjon (HPF-FS)

En av de beste fremgangsmåter som er tilgjengelige for fremstilling av de biologisk prøve for elektronmikroskopi når det gjelder den strukturelle bevaring er cryoimmobilization ved høytrykks frysing (HPF), etterfulgt av fryse substitusjon (FS). Denne metoden tillater observasjon av celler og organeller i cellen var nesten ingen innfødte artefakter (ekstraksjon, koagulasjon, strukturell forvrengning) som ofte observeres ved bruk av kjemisk fiksering. En prøve av celler eller friskt vev er lastet sammen med fyllstoff eller kryobeskyttende på en prøveholder og umiddelbart frosset ved meget høyt trykk (2000 bar) ved hjelp av HPF maskinen. Frysingen er etterfulgt av erstatning frysing, noe som skjer ved en temperatur under -70 ° C, hvor vannet (i form av is) i prøven er erstattet av det organiske løsningsmiddel i nærvær av sekundært fiksativ. Etter utskifting prøvene kan bygges inn i plast eller utvannet og behandlet med Tokuyasu teknikk for å IEM.

tynne prøver integrert epoxy seksjonert gjær S. cerevisiae (til venstre) og mus nyre (til høyre), som ble løst med HPF-FS-metoden.

Immunelek- Mikroskopi (IEM)

For lokalisering av molekyler på ultra nivået vi søke teknisk cryosectioning Tokuyasu. frisk prøve blir fiksert i 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer, nedsenket i 2,3 M sukrose i PBS og frosset i flytende nitrogen. tynne frysesnitt er merket med spesifikke antistoffer og konjugerte gull markører brukes til å vise bindingssetene av antistoffene.

HPF-FS behandlet nyre prøve av mus rehydrert og behandlet med Tokuyasu metode for å vise lokaliseringen av type IV kollagen i basalmembranen av renale tubuli (til venstre). Cryosectioned av mus netthinnen som viser lokaliseringen av Rhodopsin i stav celler (høyre).

negativ farging

enkel og rask teknikk for å analysere den detaljerte struktur av makromolekylene, og organeller isolert ved liggende mikroorganismer eller innlemme prøvepartiklene i en tett materiale av elektroner som gir en høy kontrast. En liten dråpe av prøven absorbert på en belagt karbon og glødeutladning gitter. Etter at overskudd av prøven er fjernet, er gitteret skylles et par ganger på en dråpe av destillert vann og plassert på en dråpe av flekk (1% uranylacetat og uranyl formiat). Etter farging av den overskytende væske er fjernet, og gitteret blir tørket før observasjon med TEM. Du kan også kombinere farging med negativ farging. I dette tilfelle antistoff-inkubasjoner blir utført før den negative flekken er brukt.

aktin filamenter negativ farging (til venstre). Den immunolabelled for decorin og kollagenfibre farget med uranylacetat (til høyre).

tomograf

Elektronmikroskopi tomografi er en teknikk som gjør det mulig for undersøkelse av tredimensjonale biologiske strukturer. tynn prøven er skråstilt i et vidt vinkelområde (typisk ± 70 °) om vippeaksen av goniometer fasen og gjenopptatt ved en hvilken som helst helningsvinkel (vanligvis i intervaller på 1 eller 2 °). September vippe serie kalte bilde oppnådd blir deretter behandlet for å justere bildene med hverandre og senere rekonstruere et tredimensjonalt volum. Dette volumet vises som en serie med bilder som viser parallelle skiver gjennom volumet. Direkte visualisering av volumet kan være informativt for noen strukturer og analytiske formål. Imidlertid er de segmentering metoder som ofte brukes sammen med organeller strukturer for å definere og dissekere komponenter av strukturen og for å skape en tredimensjonal modell som forenkler tolkning, oppdagelsen av innbyrdes, og måle.

Søknader SEM / Fokusert Ion Beam - scanning elektronmikroskopi (SEM-FIB)

Med denne metoden er det mulig å oppnå en serie av bilder gjennom harpiksen innleiret vevsblokk konvensjonelt fremstilt. serie av bilder med høy oppløsning justert kan deretter brukes for gjenoppbyggingen av 3D-volum, og ultrastructural analyse av cellulære strukturer. I mikroskop for å doble kilden til elektronstråle med galliumioner fokusert elektronstråle, og er anordnet i en vinkel som gjør det mulig for fjerning lag til lag av materiale fra prøveoverflaten og den etterfølgende eksponering med et scanning-elektronstråle. Prosessen er fullstendig automatisert og når området er egnet og fresing og bildebehandling parametere er satt, vil instrumentet automatisk produsere bildeserie nesten på linje.

ortogonale utsikt serie bilder hentet fra hjertevevet ved hjelp av musen skive og utsikt teknikk med FIB-SEM (til venstre). 3D-modell av en kapillær hjerte, hvor de ble segmentert endotelceller (blå og cyan) som danner det kapillære og pericytes (grønn) som omgir kapillæret og overflaten gjengis (til høyre).

SEM Programmer / korrosjon cast teknikk

Vaskulær korrosjon avstøpning er et utmerket verktøy for morfologisk undersøkelse av organer og vev mikrosirkulasjonen i normale og patologiske tilstander. I korthet er mus eller rotter perfuseres og blodet er erstattet med en lav viskositet harpiks. Etter at harpiksen har herdet, blir KOH maserasjon brukes til å fjerne den omgivende vev, og detektering av replikering av blodkar. På grunn av polyuretan-basert harpiks (PU4ii) avstøpninger er meget elastiske og formen og volumet av organer er bevart. Kaster blir normalt tatt med SEM, de kan behandles videre for analyse av konfokalmikroskopi (harpiks er autofluorescent), mikro-computertomografi (microCT), eller av optisk projeksjon tomografi (OPT), som tillater produksjon av 3D rekonstruksjoner av morfometrisk kvantitativ analyse.

Vaskulær korrosjon kastet av musen nyre observert i stereomikroskop (til venstre). SEM analyse av mus korrosjon nyre kastet viser forskjellige sløyfer som danner trange blodkar glomeruli (høyre).

verktøy:

  • Tecnai G2 Spirit 120 kV TEM med Veleta og Quemesa CCD-kameraer (BF-finansiering)
  • Sigma HD VP FE-SEM utstyrt med ET-SE og In-linse SE detektor, G3 VPSE detektor for lavt vakuum-modus, og detektor 5Q-BSD

Posisjon - Hovedbygningen på den medisinske høyskole, Aapistie 5A (Tecnai Room 467B, 492B rom CM100, Sigma FE-SEM Room 320A),
tel: + 358- (0) 294 486 144, ext. 48-6144 (Tecnai), 48-6146 (CM100)

Booking Tool:

Instrumentene kan bestilles gjennom boken reservasjon Asimov:

  • Tecnai G2 TEM Spirit
  • Sigma HD VP FE-SEM

prøveopparbeidelse laboratorium

Laboratoriet er utstyrt med moderne instrumenter for utarbeidelse av celler, organeller, og vevsprøver for de ulike EM-analyse.

utstyr:

  • ultramicrotome Leica EM UC7 angrep med cryo-EM og EM FC7 CRION ionizer
  • ultramicrotome Leica EM UC6 angrep med cryo-EM FC6
  • ULTRACUT Leica UCT ultramicrotome
  • Leica E ULTRACUT
  • EM-pakten høytrykksfryseenhet (Leica)
  • Leica EM AFS2 fryse veksler med automatisk flytende håndteringssystem (BF-finansiering)
  • Leica EM TP automatisert vev prosessor
  • K850 Critical Point Dryer
  • ES Q150T verktøy med utskiftbare innsatser for sputtering belegg eller karbon fordampning utstyrt med filmtykkelse monitor og sette glød utflod

Location - laboratorie EM, Biocenter Oulu laboratorier i hovedbygningen på medisinske høyskole, Aapistie 5A (Rom 488B, 4. etasje)
tel: + 358- (0) 294 486 144, ext. 48-6144

Kontaktpersoner:

Ilkka Miinalainen, koordinator
tel: + 358- (0) 294 486 145, ext. 48-6145
E-post: ilkka.miinalainen (at) oulu.f

Utarbeidelse av laboratorieprøver:
Sirpa Kellokumpu, Tarja Piispanen
tel: + 358- (0) 294 486 144, ext. 48-6144
E-post: firstname.lastname (at) oulu.f

prøver monteringsinstrukser:

Tissue fiksering for TEM og IEM

fiksering av dyrkede celler ved TEM og IEM

Fiksering av organeller blokker for TEM og IEM

Bestillingsskjema:

Last ned bestillingsskjemaet.
(Merk: Hvis du har problemer med å bruke skjemaet i nettleseren, kan du prøve å lagre dokumentet og fyll den i Adobe Acrobat / Reader)

priser:

Prisene for faggrupper
Prisene for kommersielle brukere



Legg igjen en kommentar