Elektronmikroskopi: mening, typer og teknikker




Elektronmikroskopi: betydning, typer og teknikker!

Betydning av elektronmikroskopi: 


Diagnose Virus elektronmikroskop er basert på deteksjon og identifikasjon av viruset på grunnlag av deres karakteristiske morfologi. Tidligere forsøk på å se viruset selv med de kraftigste optiske mikroskoper av dagen var en fiasko.

Dette er fordi utstråling av synlig lys med en gjennomsnittlig bølgelengde på omkring 5500 A °. (A ° -Angstrom enheter, tilsvarende 10-8 centimeter) var ikke i stand til å lette finere og mer detaljerte aspekter av viruspartikler, som er relativt mindre i størrelse.

De bølgelengder av lys er relativt lange. Derfor partikler med mindre størrelse kan ikke være riktig løst, dvs. identifisert utpreget og separat. Dette problemet ble løst med utviklingen av elektronmikroskop av Knoll og Ruska i 1931.

Disse instrumentene ikke bruker elektromagnetisk stråling med lengre bølgelengder. I stedet er sterke elektronstråler projisert fra en egnet kilde for å løse gjenstanden under observasjon. Bølgelengdene for disse stråler av elektroner var meget liten, ofte mindre enn 1A °. På den annen side er avstanden mellom de forskjellige atomer i et molekyl mer.

Derfor er det teoretisk mulig å oppnå oppløsninger på atomnivå ved hjelp av disse. Når oppløsning på et godt nivå dette er oppnådd, kan du ha forstørret og forstørret bildene til ønsket størrelse. Vi er i stand til å få en forstørrelse opp til 2,000,000X der, som fra normal optisk mikroskop er opp til 2000x. Ved hjelp av kikkert image det kan forsterkes til en maksimal forstørrelse 2,000,000X med JEM 100 S.

Den elektronmikroskop består av en elektronkanon, den sentrale søylen, elektromagnetiske linser og en fluorescerende skjerm (fig. 3). Elektronkanonen er plassert i den øvre delen av den mikroskopiske legeme som tjener som elektronkilde. Pistolen er laget av wolfram filament til 30 kV til 150 kV potensial. Det er omgitt av en negativ skjold med en åpning gjennom hvilken en elektronstråle er tatt.

Den midterste kolonne er et evakuert metallrør som er tilstede på toppen av kanonen. elektromagnetiske linser eller spoler er lik den kondensator, mål linser og okular linse for det optiske mikroskop og kalles kondensatoren spoler, objektiv og projektor, henholdsvis (fig. 4).

Hver spole har elektriske spoler å avvikle garn på en metallisk hul sylinder. Den elektriske strøm under passasjen gjennom disse spoler frembringer et magnetisk felt aksielt symmetrisk til midten av linsen. Magnetfeltet tvinger elektronene spiral rundt de sentrale aksen og forstørrelsesfunksjoner. Konsentratet kan oppnås ved å regulere spenningen.

De fleste elektronmikroskop operere i rang av 25-200 KV spenning. Noen opererer til 1000 kV eller mer. Det dannede bilde er observert på en fluorescerende skjerm og ikke direkte, fordi elektronene er skadelig for øynene. For å få en permanent registrering av bilder, har fotografisk materiale er innarbeidet i mikroskop for direkte eksponering av elektronstråler.
Typer av elektronmikroskop :

Det finnes to hovedtyper av elektronmikroskop:

(A) transmisjonselektronmikroskop (TEM):

Denne elektronmikroskop kan sammenlignes med et lysmikroskop (LM). Den bruker elektroner som overføres er i stand til å trenge inn i den tynne prøven.

(B) en scanning elektronmikroskop (SEM):

Dette kan sammenlignes med en disseksjon eller et stereoskopisk mikroskop. SEM benytter spredte elektroner fra prøveoverflaten, er sekundært eller tilbake spredt, og dermed gjøre et tredimensjonalt bilde.
teknikk :

Det første anlegget virus å bli observert i elektronmikroskop var tobakk mosaikk (Williams og Wykoff, 1943. Siden da elektronmikroskopi teknologi har blitt mye bedre. Mange teknikker knyttet til elektronmikroskopi har vist rimelig klare bilder av (tabell 1) et stort antall virus.

Disse teknikkene er:

Ultrathin seksjonering:

Denne teknikken er nyttig for å studere partikler i vertscellen. Og 'også nyttig å studere krystallstrukturen. Ultratynne seksjoner (25-90 nm) er produsert av faste biologisk materiale, dehydrert og integrert ved hjelp av spesielle mikrotomer (mikrotomer termisk eller mekanisk forhånd) og glass eller diamantkniver med svært skarpe kanter og harde kanter.

De optimale egenskapene til en ultra-tinn seksjoner er:

(I) tykkelse 30-60 nm.

(Ii) konsistensen tilstrekkelig til å understøtte elektronstråle.

(Iii) Utsatt for god kontrast gjennom sitt slektskap med fargestoffer.

Glass kniver er laget ved å skjære et spesielt glass for å få en skarp cutting edge. Den første modellen er konstruert av Sorvall i 1953 og er kjent som Sorvall MT1. Et svensk firma produserer ultra-kommersielle mikrotomer med "ultratome" merkevare.
negativ farging :

negativ farging er en enklere kvalitativ metode for å undersøke strukturen av organeller isolerte, individuelle makromolekyler og elektronmikroskopi nivå virus. Dette er en meget nyttig teknikk for sin enkelhet og hastighet, og også fordi den ikke krever spesialisert utstyr som er forskjellig fra en vanlig laboratorie-elektronmikroskopi.

Hall (1955) var den første som tilfeldigvis viser negativ farging effekt i en studie hvor cobs ble farget positivt med fosfowolframsyre. partikler ikke helt vasket ble omringet og innlemmet i reagent tørket, og i stedet for å vises mørkt på en lys bakgrunn, ble de sett lyset på en mørk bakgrunn (Fig. 5).

Huxley (1955) har merket seg uavhengig den samme virkning med tobakkmosaikkvirus. Brenner et. til. (1959) observerte også det samme fenomen og kalte det er negativ farging. I denne teknikken metallbeis forbindelsene er avsatt rundt viruspartikler, slik at omriss som omgir virus og gjøre elektro-tett. I motsetning til dette forblir hele viral partikkel område blank trans til elektronene.

Noen hoved negative flekker med normal pH for bruk er:

Natrium- eller fosfotungstatat (PTA) - 5 til 8

Uranylacetat - 04.02 til 04.05.

Ammoniummolybdat - 5 til 7

Metylamin tung - 5-7

Fosfotungstatat (PTA) er en av de mest brukte negativ statin. Fremstillingen av viruset ble farget med en vandig løsning ved 2% av PTA, brakt til pH 7,0 med NaOH eller KOH. Flytende gittere med adsorberte viruspartikler, en reduksjon på 0,1% glutaraldehyd i 5 minutter før farging med PTA reduserer skade på viruspartikler.

Ammoniummolybdat ved pH 6 og 7 kan brukes til farging av frø av soyabønner dvergvirus stammer (SbDV). Den viktigste negative farging av meningen er å omgi eller legge biologisk objekt i en spesiell elektron tett materiale som gir høy kontrast og god bevaring.
positiv farging :

I denne teknikken salter av tungmetaller feste til de ulike organeller eller makromolekyler innenfor den delen av å øke sin elektrontettheten og virker mørke mot en lysere bakgrunn. Noen positive flekker er: uranylacetat (UA), citrate Reynoldi av bly. uranyl ioner sterkt reagerer med fosfat og aminogrupper, slik at nukleinsyrer og visse proteiner som er sterkt farget. En 25% oppløsning av UA fremstilles i absolutt metanol. Denne mettede oppløsning klares ved filtrering gjennom et sprøytefilter (2 mikrometer porestørrelse) like før bruk.

Bly i bly-ioner citrate flekken Reynoldi binder negativt ladet komponenter av membraner og Osmium-reagerte områder ie. Denne flekk kan fremstilles ved å tilsette 1,33 gm. bly nitrat og 1,76 g. natriumcitrat i 30 ml. CO2-fri destillert vann. Det kokes i 10 minutter. Til denne melkeaktig suspensjon av 5 til 7 ml / tilsettes N NaOH. Avbryter suspensjon. Dette punktet er lagret i 50 mL målekolbe.
Sammenligning mellom negativ og positiv farging farging:

negativ farging er en teknikk som brukes for å fremstille prøver for undersøkelse under elektronmikroskop. Prøven blandes med en elektron tett materiale som trenger inn i mellomrommene i prøven, men ikke den prøve av det samme materiale. Prøven vises så klart mot en ugjennomsiktig bakgrunn.

Den positive flekk-stick med prøven og gir sin farge i hvilken, som en negativ flekken ikke blande seg med mester, men settling rundt sin ytre kant, som danner en silhuett (omriss). Den negative flekken frembringer en mørk bakgrunn rundt cellen (Fig. 5).


skygging metall :

skygging metall er en teknikk som gjør det overflatedetaljer av meget små partikler som er synlige i elektronmikroskop. I denne teknikken et tynt metall-lag inndampet slik som gull eller platina er anordnet i en vinkel i en biologisk prøve. Et bad løser opp organisk syre

materiale, og etterlater et metall replika av dens overflate, som deretter kan undersøkes under et transmisjons-elektronmikroskop (TEM).

Variasjon av vinkel og tykkelsen av metallet avsettes for å danne et bilde, fordi det tillater at noen elektroner ulykker vil bli spredt i forskjellige retninger i stedet for å gå gjennom preparatet. Dersom metallforekomster hovedsakelig på siden av prøven, synes bildet for å ha "skygger" hvor metallet er mørkt og skygger lys.

Positiv farging er også brukt i prøvepreparering for undersøkelse i elektronmikroskop, men i denne teknikken involverer makromolekyler eller biologiske strukturer er utført tette elektroner slik at tungmetallioner av motsatt ladning til å binde dem sammen.

metode:

Prøven er spredt på en glimmer ark og deretter tørket i en vakuum-fordamper. En tung metalltråd slik som platina eller gull er elektrisk oppvarmet, slik at metallet fordampning, og noen av dem faller på prøven gitteret i en meget tynn film. For å stabilisere replikasjon, blir prøven deretter belagt med et karbonsjikt fordampet fra en elektrode over-hodet. Det biologiske materialet blir så oppløst ved syre bare observere prøven metall replikering. områder av karbon-belagte elektronmikroskop av et slikt preparat, bildet blir vanligvis reversert vises soner av lys og skygge platina virker mørke.

frysetørking :

For å fjerne fuktighet (for eksempel fra mat) ved først å fryse og deretter underkastes for høyvakuum brukt som vill fremgangsmåte for tørking av matvarer og kjemikalier mens forårsaker lite dekomponering kalles frysing eller tørking av en matvare eller blodplasma tørkemetode eller farmasøytisk eller vev uten å ødelegge deres fysiske struktur, er materialet frosset og deretter oppvarmet i et vakuum, slik at isen sublimerer (for biokjemi den lyofiliserte begrepet brukes ofte).

frysetørking teknikk bidrar til å oppnå en korrekt idé om formen av partiklene. Morfologien av viruset har blitt studert med et utvalg av elektron mikroskopiske metoder. Men de fleste av disse teknikkene krever en forbehandling som kan innføre strukturelle endringer i objektet. Metallet skygging og negativ farging som ikke krever festing kan føre til krymping under tørkeprosessen.

Videre kan de endre eller ødelegge gjenstanden som det ble vist til hele viruspartikler. For å overvinne skadelig uttørkende effekt på den biologiske struktur Wychoff forsøkt å hindre at viruset ved frysing av røret i en kald metallblokk og fordampning av is i en vakuumfordamper. Williams har utviklet en forbedret fremgangsmåte for lyofilisering av virus, membraner, etc.

metode:

Farging frysing teknikken har blitt beskrevet i detalj av Williams (1952). Denne teknikk innebærer hurtig frysing av prøven og det tynne lag av vann som dekker på rutenettet til hvilken ble adsorbert etterfulgt av sublimering av isen rundt den. En tynn, tungmetallsjikt avsettes så på overflaten dehydratiseres for å gi kontrast.


Carbon Replica :

Fremstilling av karbon i likhet med gips formene replikasjon blir fremstilt i mange tilfeller, for å fremheve de overflate-egenskapene til de virale partikler.

Viktigheten av elektronmikroskopi:

Elektronmikroskopi viser morfologien og tillate:

(I) Måling av størrelsen av den virale partikkel

(Ii) kan indikere mulig sjanger

(Iii) Nyttig når du ikke vet noe om identiteten til viruset.

(Iv) resultatene innen 1-2 timer.



Legg igjen en kommentar