Funksjonen til flavin cytoplasmisk reduktase i reduksjon av azofargestoffer av bakterier




Det er mange rapporter som beskriver reduksjonen av azoforbindelser av bakterier i anaerobe betingelser. Hovedinteressen i dette feltet har fokusert på bakterier i tarmen som er involvert i metabolismen av azofargestoffer inntatt som tilsetningsstoffer i mat, og det er noen studier som peker til bakterier isolert fra jord systemer eller kloakkrenseanlegg ( 5, 6, 8, 27, 29, 31). Tidligere studier har blitt utført primært med fakultative anaerobe bakterier (for eksempel Proteus vulgaris, Streptococcus faecalis, eller Bacillus sp.). Hadde vært gjentatte ganger foreslått at i disse stammene, cytosoliske reduktase flavin avhengige er ansvarlig for denne reaksjonen er ikke spesifikk og at den lave permeabiliteten av cellemembraner for sterkt polare sulfonerte azoforbindelser ville føre til vesentlig lavere priser for reduksjon observert med hele celler sammenlignet med de i acellulære systemer (19, 27, 36). Fordi ingen av disse azo cytosolic reduktase har aldri blitt renset, så langt det har vært spekulativ hvis reduktase bakteriell Flavin var ansvarlig for azo-reduktase aktivitet observert med bakteriecelleekstrakter. Den foreliggende undersøkelse har vist at Flavin-reduktase er nemlig i stand til å virke som azo-reduktase og som av celleekstrakter inneholdende det klonede Flavin-reduktase avfarges et bredt utvalg av azo-fargestoffer industriell interesse.

Våre resultater tyder på at reduksjonen av sulfonerte azofargestoffer ved redusert flavins dannet av cytosoliske flavin-avhengig reduktase azo blir for det meste observert in vitro og in vivo er ubetydelige. Dette har blitt tydelig med den rekombinante stamme BN6 (pRJR34), og in vitro øker betydelig azo-reduktase-aktivitet sammenlignet med vill-type, selv om det er blitt funnet in vivo bare en liten økning azo-reduktase. Teoretisk sett kan dette også ha blitt forårsaket av en mangel på nødvendige kofaktorer (NADH og / eller gratis flavins) i hvilende celler. Dette synes å være lite sannsynlig, fordi cellene ble inkubert anaerobt bør ha ganske høy konsentrasjon av NADH. Det er kun begrenset informasjon om innholdet Flavin fri for bakterieceller. Det ble imidlertid observert at rekombinante luciferasepreparater FMN-ansatte er i full drift i ulike bakterie miljøer uten samtidig overføring av rekombinant FMN reduktase (34). Det har også vist seg nylig for BN6 stamme (J. Klein, personlig kommunikasjon). Dette tyder på at en ledig flavins reduksjon er tilstede i forskjellige bakterier og også i BN6 belastning i mengder som tillater støtte av enzymatiske reaksjoner som krever redusert flavins.



ytterligere indikasjon på at azo-reduktase Flavin avhengige er nesten helt laboratorie gjenstander har blitt demonstrert av effektene av flavins lagt utvendig på azo reduksjon priser i anaerobe forhold. Således er det blitt funnet at tilsetning av FAD til en stamme av BN6 hvilende cellesuspensjon ført til noen betydelig økning i azofargestoff reduksjonsforhold. Tvert imot, tilsetningen av den samme konsentrasjon av antrakinon-2,6-disulfonat resulterte i en økning på nesten 10 ganger hastigheten for reduksjon av farvestoffet (17). Lignende observasjoner ble også gjort med Sphingomonas sp. belastning BN6 (pRJR34) og E. coli JM109 (DE3) (pEE1001) (upubliserte resultater). Dette tyder på at de bakterielle membraner er ikke bare effektive barrierer mot diffusjon av sulfonerte azofargestoffer, men også er neppe gjennomtrengelig til flavin-inneholdende kofaktorer og dermed begrense overføringen av reduserende ekvivalenter fra flavins fra cytoplasma av intakte celler av sulfonerte azo-fargestoffer i kulturmediet. Således, i levende celler med intakte cellemembraner, andre enzymsystemer og / eller andre redox-mediatorer er antagelig ansvarlig for reduksjon av azofargestoffer. I bakterier som egne sendesystem av elektroner i sine membraner, som for eksempel bakterier rent aerobisk eller fakultativt anaerobe undersøkt i denne rapporten, kan overføring av redox-ekvivalenter av respiratoriske kjeden av cellemembranene til passende redoks-mediatorer finner sted direkte. Hvis intracellulær reduktase bør være involvert i denne prosessen, kan det antas at andre enn flavin co-faktorer meklere må være involvert. En forutsetning for disse mediatorer vil ha en større evne til å overføre bakterielle membraner enn det som flavins.

Et annet konsept for reduksjon av sulfonerte azoforbindelser som heller ikke krever et membrantransport av fargestoffer som har vært foreslått for strengt anaerobe bakterielle stammer av mikrofloraen i tarmen. Rafii og isolerte forskjellige menneskelige samarbeidspartnere bakterier fra tarmen (for eksempel, Eubacterium sp., Clostridium sp., Butyrivibrio sp., Eller Bacteroides sp.), Avfarves Hva sulfonert azofargestoffer under vekst på faste eller flytende kompleks terreng. E 'ble vist at i det minste en del av azo-reduktase-aktivitet var ekstracellulær, fordi supernatantene var i stand til å decolorize fargestoffer under anaerobe forhold (24, 25). Dette ekstracellulære azo-reduktase-aktiviteten skyldes aktiviteten av spesifikke proteiner, fordi etter nondenaturing SDS-PAGE og farging aktivitet under anaerobe betingelser, er vanligvis bare én distinkt proteinbånd på gelen var i stand til å bleke fargestoffer (21). I de fleste av isolatene, var nødvendige for azoforbindelser flavin-reduktase, men i noen clostridia, azo-reduktase-aktivitet var uavhengig flavine tilsatt eksternt (24). Nylig ble et DNA-fragment fra Clostridium perfringens klonet i fag GT11, som har økt AZO-reduktase-aktiviteten av lytiske og lysogene kulturer av E. coli infisert med den rekombinante fag (23). Azo-reduktase fra C. perfringens ble påvist ved immunelek- mikroskopi gjennom cytoplasma og i nærheten av cellene (22). Dette tyder på at proteinet er ikke en typisk ekstracellulært enzym, men som antagelig bare frigjort fra lyserte celler. Azo-reduktase-aktivitet av C. perfringens er klart forskjellig fra Flavin-reduktase undersøkt i dette studiet, fordi enzymaktiviteten har blitt beskrevet som uavhengig av den fra flavins tilsatt, og, også, enzymet ble hurtig og irreversibelt med inaktivert oksygen (24). Det er fremdeles uklart i dette systemet som azoreductases ekstracellulære suppositorier bør skaffe NADH som er nødvendig for reduksjon av azofargestoffer i sitt ekstracellulære miljø, og det kan være noen effekter fra de komplekse middel for vekst av bakterier. I tillegg er det noen andre publikasjoner om reduksjon av azo-forbindelser til hele cellepreparater av strengt anaerobe bakterier som har antydet involvering av redoks mediatorer (3, 4). Derfor er det ikke utenkelig at de ekstracellulære mediator forbindelsene også deltar i reduksjonen av azo-forbindelser ved strengt anaerobe bakterier.

Den tredje mulighet for den ekstracellulære reduksjon av azofargestoffer forårsaket av mikroorganismer er virkningen av reduserende uorganiske forbindelser (Fe2 , H2S), som dannes som sluttprodukter av enkelte strengt anaerobe bakterier. Videre, i disse tilfellene kan mekleren forbindelsen har en viktig funksjon (13, 37).

Det kan konkluderes at, avhengig av miljøforhold (eller reaksjonsbetingelsene i en bioteknologisk fremgangsmåte), forskjellige reaksjoner katalysert av bakterier kan oppnå reduksjon av azo-forbindelser under anaerobe betingelser, men at de intracellulære reaksjonene har bare ubetydelig betydning i disse reaksjoner.



Legg igjen en kommentar